EPR Spin-Trapping for Monitoring Temporal Dynamics of Singlet Oxygen during Photoprotection in Photosynthesis  

EPR自旋捕獲技術用于監(jiān)測光合作用光保護過程中單線態(tài)氧的時間動態(tài)  

來源：Biochemistry 2024, 63, 1214-1224  

《生物化學》2024年第63卷第1214-1224頁  

 

摘要內(nèi)容：  

摘要提出了一種結合電子順磁共振（EPR）自旋捕獲和時間分辨熒光光譜的方法，用于實時監(jiān)測植物類囊體膜在光保護過程中單線態(tài)氧（1O?）的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)光照1小時期間，1O?的表觀濃度先下降后上升。光照初期，1O?濃度的下降與非光化學淬滅（NPQ）激活導致的葉綠素熒光壽命縮短同步；而使用跨膜質子梯度解偶聯(lián)劑尼日利亞菌素（nigericin）會延遲NPQ和1O?的調(diào)節(jié)。NPQ飽和后，無論是否處理，1O?*濃度均上升，表明NPQ在短期內(nèi)（前10分鐘）通過耗散過剩能量減輕光氧化壓力。  

 

研究目的：  

明確光合作用光保護過程中單線態(tài)氧（1O?）的動態(tài)調(diào)控機制，驗證NPQ（非光化學淬滅）對1O?產(chǎn)生的抑制作用，并開發(fā)一種能實時監(jiān)測復雜生物系統(tǒng)中1O?*濃度變化的方法。  

 

研究思路：  

方法優(yōu)化：先在染料系統(tǒng)（如玫瑰紅RB和甲苯胺藍TB）中驗證EPR自旋捕獲技術檢測1O?*的可行性（圖1B, 1C）。  

 

 

生物應用：將優(yōu)化后的EPR方法應用于植物類囊體膜，結合時間分辨熒光光譜測量葉綠素熒光壽命（圖6A-C），分析NPQ與1O?*的時間相關性。  

 

 

條件調(diào)控：通過添加解偶聯(lián)劑（nigericin）破壞跨膜質子梯度，研究其對NPQ和1O?*動態(tài)的影響（圖5C, 6E-F）。  

 

 

測量的數(shù)據(jù)及意義（標注對應圖表）：  

EPR信號動力學（圖2A, 3B, 4）：通過監(jiān)測TEMPO自由基的生成和衰減，量化1O?*濃度變化，驗證光照強度和氧氣濃度對光敏化反應的影響。  

 

 

 

 

熒光壽命數(shù)據(jù)（圖6A-C）：測量葉綠素熒光壽命變化，反映NPQ的激活程度（NPQ值計算為（τ_dark?τ(t)）/τ(t)）。  

氧氣釋放數(shù)據(jù)：使用丹麥Unisense電極（Oxy-NP探針）驗證類囊體膜的放氧活性，確保實驗體系的生理相關性。  

 

研究結論：  

NPQ在光照初期通過縮短葉綠素激發(fā)態(tài)壽命顯著減少1O?*生成（前10分鐘）。  

長時間光照后（>15分鐘），抗氧化系統(tǒng)飽和導致1O?*濃度回升，表明NPQ的短期保護作用。  

跨膜質子梯度（ΔpH）是NPQ激活的關鍵因素，解偶聯(lián)劑nigericin延遲了NPQ和1O?*的動態(tài)響應。  

 

丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細解讀：  

使用Unisense Oxy-NP探針測量了類囊體膜的氧氣釋放活性，驗證了分離膜的生理功能完整性。該數(shù)據(jù)確認了類囊體在實驗條件下仍保持光驅動的水分解能力（即光系統(tǒng)II活性），排除了樣本制備過程中可能導致的膜損傷對后續(xù)結果的干擾。這一測量為后續(xù)EPR和熒光實驗提供了生物學有效性支持，確保觀測到的1O?*動態(tài)變化真實反映光合膜的自然響應，而非人工假象。