Unraveling the interaction of co-encapsulated Saccharomyces cerevisiae and Metarhizium brunneum in calcium alginate-based attract-and-kill beads

揭示基于海藻酸鈣的誘殺珠中共包埋釀酒酵母和布氏綠僵菌的相互作用

來源：Pest Manag Sci 2024; 80: 5131–5140   Pest Management Science published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of Society of Chemical Industry

《害蟲管理科學(xué)》，由John Wiley & Sons Ltd代表化學(xué)工業(yè)學(xué)會(huì)出版

摘要內(nèi)容：

摘要介紹了誘殺珠（AK beads）作為生物殺蟲劑的背景，其通過共包埋產(chǎn)二氧化碳（CO?）的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, SC）作為引誘成分和昆蟲病原真菌布氏綠僵菌（Metarhizium brunneum, MB）作為殺滅成分來控制土壤害蟲（如金針蟲）。研究首次使用微電極測量了珠內(nèi)氧氣和pH的時(shí)空分布，并分析了SC負(fù)載量對(duì)CO?產(chǎn)量和MB分生孢子形成的影響。結(jié)果表明，共培養(yǎng)導(dǎo)致珠內(nèi)形成陡峭的氧梯度（中心缺氧）和暫時(shí)性強(qiáng)酸化（最低pH 3.6），且酸化與CO?產(chǎn)量峰值及分生孢子形成高峰期重合。降低SC負(fù)載量雖減少了CO?和分生孢子的總產(chǎn)量，但單位酵母負(fù)載的比生產(chǎn)率顯著提高。結(jié)論指出SC與MB存在互利作用，但也存在資源競爭，優(yōu)化配方可提高效率。

研究目的：

闡明SC與MB在鈣-海藻酸酯/淀粉珠中共培養(yǎng)時(shí)的物理化學(xué)過程（氧氣、pH分布）及相互作用機(jī)制，探究SC負(fù)載量對(duì)CO?引誘效率和MB分生孢子殺滅效率的影響，為開發(fā)高效、低成本的生物殺蟲劑配方提供依據(jù)。

研究思路：

制備不同組分的珠： 設(shè)計(jì)7種珠配方（表1、2、3），包括空白對(duì)照（僅海藻酸鈣、海藻酸鈣/淀粉）、單菌封裝（SC或MB）及共封裝（AK珠）。

微電極原位測量：

使用丹麥Unisense氧微電極（Clark型）測量不同配方珠在培養(yǎng)第2天和第6天的氧氣空間分布（圖3）。

使用Unisense pH玻璃微電極測量含淀粉配方珠在0、1、3、5、7、16天的pH時(shí)空變化（圖4）。

評(píng)估真菌生產(chǎn)力：

改變AK珠中SC負(fù)載量（0%、1%、5%、10%、16.7%），測量其CO?釋放量隨時(shí)間（0-14天）的變化（圖5A）。

測量不同SC負(fù)載量下，MB在珠表面的分生孢子濃度隨時(shí)間（0、3、7、10、14天）的變化（圖5B）。

數(shù)據(jù)分析： 結(jié)合物理化學(xué)數(shù)據(jù)（O?、pH）與生物活性數(shù)據(jù)（CO?、孢子），解析SC與MB的相互作用及其對(duì)AK珠功效的影響。

測量的數(shù)據(jù)及其研究意義：

珠內(nèi)氧氣分布（圖3）：

數(shù)據(jù)： 共封裝（AK）珠在第2天即出現(xiàn)陡峭氧梯度，中心氧水平降至6.5%，形成缺氧區(qū)，此狀態(tài)維持至第6天。單封裝SC或MB珠也降低內(nèi)部氧水平，但程度較輕（中心約60-83%）。添加淀粉對(duì)氧分布無顯著影響。

研究意義： 首次原位揭示了AK珠內(nèi)部存在嚴(yán)重且持續(xù)的氧氣限制（缺氧），表明高代謝活性和/或氧擴(kuò)散受限。這解釋了共培養(yǎng)的高呼吸活性，并提示氧氣可能成為限制因子，影響微生物生長和代謝（如酵母呼吸方式、真菌產(chǎn)孢）。

珠內(nèi)pH時(shí)空變化（圖4）：

數(shù)據(jù)： 共封裝（AK）珠在第3天出現(xiàn)顯著時(shí)空酸化，珠外圍800μm區(qū)域pH降至3.6，隨后恢復(fù)。單封裝SC或MB珠也降低珠內(nèi)pH（約4.6-4.7），但無梯度且波動(dòng)小。酸化高峰期（第3天）與CO?產(chǎn)量峰值及分生孢子形成高峰期重合。

研究意義： 揭示了共培養(yǎng)導(dǎo)致的獨(dú)特且劇烈的局部酸化現(xiàn)象。酸化與關(guān)鍵生物活性（CO?引誘和孢子殺滅）高峰同步，表明代謝活動(dòng)（如酵母產(chǎn)酸、CO?溶解成碳酸）強(qiáng)烈影響微環(huán)境。極端pH可能影響微生物活性、酶功能及相互作用。

不同SC負(fù)載下的CO?生產(chǎn)力（圖5A）：

數(shù)據(jù)： CO?總產(chǎn)量隨SC負(fù)載降低而顯著減少（16.7%負(fù)載總產(chǎn)量最高）。但單位酵母負(fù)載的比CO?生產(chǎn)率隨負(fù)載降低而顯著提高（1%負(fù)載時(shí)比生產(chǎn)率最高，達(dá)16.7%負(fù)載的8倍）。所有負(fù)載下CO?生產(chǎn)率均在初期（<3天）最高后下降。

研究意義： 量化了SC負(fù)載對(duì)引誘效率（CO?）的影響。高負(fù)載雖總量高，但資源利用率（比生產(chǎn)率）低，提示資源競爭或環(huán)境壓力（如O?限制、酸化）抑制了細(xì)胞活性。優(yōu)化負(fù)載可提高成本效益。

不同SC負(fù)載下的分生孢子形成（圖5B）：

數(shù)據(jù)： 分生孢子總產(chǎn)量和早期（0-3天）產(chǎn)孢速率均隨SC負(fù)載降低而顯著減少（16.7%負(fù)載最高）。但單位酵母負(fù)載的比產(chǎn)孢速率在低負(fù)載（<10%）下顯著提高。標(biāo)準(zhǔn)負(fù)載（16.7%）下產(chǎn)孢無滯后期且速率峰值最高。

研究意義： 明確了SC負(fù)載對(duì)殺滅效率（孢子產(chǎn)量與速度）的關(guān)鍵作用。高負(fù)載促進(jìn)MB快速大量產(chǎn)孢，可能是通過提供營養(yǎng)（死細(xì)胞）或觸發(fā)產(chǎn)孢信號(hào)。低負(fù)載下比速率提高同樣提示高負(fù)載存在抑制因素（競爭、壓力）。產(chǎn)孢速度對(duì)田間快速起效至關(guān)重要。

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義（詳細(xì)解讀）：

丹麥Unisense微電極（氧電極和pH電極）的應(yīng)用是本研究的核心技術(shù)亮點(diǎn)，其測量數(shù)據(jù)具有以下重要研究意義：

首次原位揭示微環(huán)境時(shí)空動(dòng)態(tài)： 傳統(tǒng)方法只能測量珠整體或培養(yǎng)液的環(huán)境參數(shù)平均值。Unisense微電極具有高空間分辨率（微米級(jí)），能原位、無損地穿刺進(jìn)入珠內(nèi)部，連續(xù)測量不同深度（從表面到中心）的O?和pH值。這首次繪制了AK珠內(nèi)部的空間梯度（圖3氧梯度，圖4 pH梯度）和時(shí)間演變（圖4 pH隨時(shí)間變化），提供了前所未有的微觀視角。

闡明共培養(yǎng)特有的物理化學(xué)脅迫： 數(shù)據(jù)清晰顯示，只有SC和MB共封裝（AK珠） 才會(huì)導(dǎo)致：

嚴(yán)重且持續(xù)的缺氧核心區(qū)（圖3）： 中心O?接近零，表明強(qiáng)烈的呼吸消耗遠(yuǎn)超O?擴(kuò)散補(bǔ)給能力。這解釋了為何高酵母負(fù)載下比生產(chǎn)率低——缺氧可能迫使酵母進(jìn)行低效的發(fā)酵代謝，并抑制MB生長。

劇烈的局部酸化（圖4）： 外圍區(qū)域pH驟降至3.6，遠(yuǎn)低于單菌培養(yǎng)。這直接關(guān)聯(lián)到酵母的旺盛代謝（產(chǎn)酸、CO?溶解）和共培養(yǎng)的高活性。極端pH可能抑制酶活性、營養(yǎng)吸收，甚至損傷細(xì)胞。

將微環(huán)境變化與生物活性峰值關(guān)聯(lián)： pH測量數(shù)據(jù)（圖4）顯示，AK珠的強(qiáng)酸化（pH 3.6）發(fā)生在培養(yǎng)第3天。這與生物活性測量結(jié)果（圖5）完美吻合：第3天是CO?生產(chǎn)率峰值期（圖5A）和分生孢子形成速率高峰期（圖5B）。這種時(shí)空關(guān)聯(lián)強(qiáng)烈表明，劇烈的代謝活動(dòng)（由共培養(yǎng)驅(qū)動(dòng)）是導(dǎo)致微環(huán)境酸化（pH）和耗氧（O?）的主要原因，同時(shí)這些微環(huán)境變化也可能反饋調(diào)節(jié)（促進(jìn)或抑制）生物活性（如酸化峰值與產(chǎn)孢高峰重合）。

為優(yōu)化配方提供關(guān)鍵機(jī)制依據(jù)： 微電極數(shù)據(jù)揭示了高負(fù)載（標(biāo)準(zhǔn)16.7%）下存在的核心問題——資源（O?）競爭和微環(huán)境（pH, O?）脅迫。這直接解釋了為何降低SC負(fù)載能大幅提高比生產(chǎn)率（單位酵母的CO?和孢子產(chǎn)出，圖5）：減輕了細(xì)胞密度，緩解了O?限制和局部環(huán)境壓力，使剩余細(xì)胞能更高效地工作。這為“減少應(yīng)用量以節(jié)省成本”的優(yōu)化策略提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。

指導(dǎo)未來設(shè)計(jì)方向： 發(fā)現(xiàn)的O?梯度（圖3）表明珠中心區(qū)域可能因缺氧而利用率低下。這提示減小珠直徑可能改善O?擴(kuò)散，提高整體效率。pH的時(shí)空動(dòng)態(tài)也為理解微生物如何在受限空間內(nèi)相互作用和適應(yīng)提供了新見解。

結(jié)論：

物理化學(xué)過程： SC與MB共培養(yǎng)在AK珠內(nèi)創(chuàng)造了獨(dú)特的微環(huán)境：快速形成陡峭的氧梯度（中心缺氧）和暫時(shí)的強(qiáng)酸化（外圍pH最低至3.6）。酸化高峰期與CO?產(chǎn)量峰值及MB分生孢子形成速率高峰期重合（圖3, 圖4, 圖5）。

SC負(fù)載的影響：

降低SC負(fù)載量顯著減少了CO?總產(chǎn)量和分生孢子總產(chǎn)量及早期產(chǎn)孢速率（圖5A, B如下）。

但單位SC負(fù)載的比CO?生產(chǎn)率和比分生孢子生產(chǎn)率在低負(fù)載（尤其1%）下顯著提高（最高達(dá)8倍和3倍），表明高負(fù)載（16.7%）下存在資源競爭或環(huán)境壓力導(dǎo)致的效率抑制（圖5A, B如下）。

標(biāo)準(zhǔn)負(fù)載（16.7%）對(duì)快速啟動(dòng)分生孢子生產(chǎn)（無滯后期）至關(guān)重要（圖5B如下）。

相互作用本質(zhì)： SC和MB在AK珠中存在互利（協(xié)同）作用（如MB降解淀粉供SC利用，SC可能提供營養(yǎng)或信號(hào)促進(jìn)MB產(chǎn)孢），但也存在對(duì)資源（如氧氣）的競爭。高SC負(fù)載加劇了競爭和微環(huán)境脅迫（缺氧、酸化）。

應(yīng)用價(jià)值： 理解這些相互作用和微環(huán)境限制有助于優(yōu)化AK珠配方（如調(diào)整SC負(fù)載量、珠尺寸），在保證足夠引誘（CO?）和快速殺滅（孢子）效果的前提下，最大化資源利用效率（提高比生產(chǎn)率），從而降低應(yīng)用劑量和成本。微電極技術(shù)是解析此類復(fù)雜共培養(yǎng)系統(tǒng)微環(huán)境的關(guān)鍵工具。