Hydrogen production by a fully de novo enzyme （微生物產(chǎn)氫）通過(guò)完全從頭酶制氫

來(lái)源：Dalton Trans., 2024, 53, 12905–12916

 

1. 論文摘要核心內(nèi)容

 

研究對(duì)象：基于全新設(shè)計(jì)的三α螺旋蛋白（a3C）和鈷基催化劑（鈷肟，cobaloxime）構(gòu)建的人工酶。

核心發(fā)現(xiàn)：該人工酶在中性水溶液中通過(guò)電化學(xué)、光化學(xué)和化學(xué)還原三種途徑高效催化產(chǎn)氫（HER）。

創(chuàng)新點(diǎn)：首次證明小分子從頭合成蛋白（de novo protein）可作為酶支架，用于開(kāi)發(fā)生物啟發(fā)的可持續(xù)產(chǎn)氫系統(tǒng)。

性能：產(chǎn)氫轉(zhuǎn)化數(shù)（TON）達(dá)游離鈷肟的80%，但速率為其40%，表明蛋白環(huán)境對(duì)催化動(dòng)力學(xué)有調(diào)控作用。

 

2. 研究目的

 

解決關(guān)鍵挑戰(zhàn)：傳統(tǒng)鈷肟催化劑需有機(jī)溶劑且水相穩(wěn)定性差，限制其實(shí)際應(yīng)用。

核心目標(biāo)：設(shè)計(jì)水溶性、基于豐產(chǎn)元素（Co）的人工氫酶，實(shí)現(xiàn)中性水中高效產(chǎn)氫。

科學(xué)意義：探索人工蛋白支架在優(yōu)化催化劑性能（穩(wěn)定性、效率）中的作用。

 

3. 研究思路

 

分子設(shè)計(jì)：

通過(guò)非天然氨基酸（3-甲基吡啶-半胱氨酸）將鈷肟共價(jià)錨定于a3C蛋白的32位點(diǎn)（圖1）。

 

結(jié)構(gòu)表征：

驗(yàn)證鈷肟結(jié)合（質(zhì)譜、UV-Vis）、蛋白折疊（圓二色譜）、鈷價(jià)態(tài)（EPR）及電化學(xué)行為（循環(huán)伏安）。

功能測(cè)試：

在電化學(xué)、光化學(xué)（[Ru(bpy)?]2?/抗壞血酸體系）和化學(xué)還原（[Eu(EGTA)]2?）條件下量化產(chǎn)氫性能。

機(jī)制分析：

對(duì)比游離鈷肟與人工酶的活性差異，探討蛋白微環(huán)境對(duì)催化動(dòng)力學(xué)的影響。

 

4. 關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

（1）結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)

 

圖2A（MALDI-ToF-MS）：

質(zhì)譜峰證實(shí)鈷肟成功連接至蛋白（m/z 7550.5 → 鈷肟-蛋白復(fù)合物）。

意義：驗(yàn)證人工酶合成路徑可行性。

 

圖2B（圓二色譜）：

鈷肟結(jié)合后α-螺旋含量降至50%（游離a3C為78%），但整體穩(wěn)定性不變（ΔG~-4.3 kcal/mol）。

意義：蛋白結(jié)構(gòu)可容忍金屬催化劑嵌入，維持基本折疊。

圖2C（EPR）：

Co(II)信號(hào)（g≈2.3）證實(shí)還原態(tài)鈷中心存在，譜線差異表明蛋白環(huán)境限制溶劑配位。

意義：蛋白微環(huán)境調(diào)控鈷的配位結(jié)構(gòu)。

圖2D（循環(huán)伏安）：

人工酶（3）與游離鈷肟（2）還原電位相近（-0.90 V vs. NHE），但催化電流形狀不同。

意義：蛋白支架保留電催化活性，但影響電子傳遞路徑。

 

（2）產(chǎn)氫性能數(shù)據(jù)

 

光化學(xué)產(chǎn)氫（圖3B-C & 表1）：

圖3B（Unisense實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)）：pH 6.2時(shí)，人工酶（3）TON=49（游離鈷肟TON=62）。

圖3C（GC終點(diǎn)檢測(cè)）：pH 6時(shí)人工酶產(chǎn)氫量（41 μM H?/μM催化劑）略高于游離鈷肟（33 μM）。

表1（動(dòng)力學(xué)參數(shù)）：pH 7時(shí)人工酶速率（2.5 μmol H?/min/μmol cat）為游離催化劑的40%。

 

 

化學(xué)還原產(chǎn)氫（圖4 & 表1）：

圖4A-B：[Eu(EGTA)]2?還原下，人工酶初始速率顯著低于游離鈷肟（pH 7: 6.0 vs 2.5 μmol/min/μmol cat）。

意義：蛋白環(huán)境減緩電子/質(zhì)子傳遞，但提升pH適應(yīng)性（pH 6活性反超）。

 

 

5. 核心結(jié)論

 

成功構(gòu)建人工氫酶：首次將鈷肟整合至從頭設(shè)計(jì)蛋白支架，實(shí)現(xiàn)中性水中多途徑產(chǎn)氫。

蛋白支架的雙重作用：

優(yōu)勢(shì)：提升催化劑水溶性及pH穩(wěn)定性（pH 5-8保持活性），保護(hù)活性中心。

局限：空間位阻降低傳質(zhì)速率，導(dǎo)致產(chǎn)氫速率下降至游離催化劑的40%。

應(yīng)用潛力：小分子從頭合成蛋白（高效原子經(jīng)濟(jì)性）可作為可擴(kuò)展生物啟發(fā)催化劑的理想支架。

 

6. Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀與研究意義

數(shù)據(jù)來(lái)源

 

圖3B：光催化產(chǎn)氫的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)曲線（Unisense H?微傳感器監(jiān)測(cè)）。

圖4A-D：化學(xué)還原產(chǎn)氫的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)曲線（同前）。

表1：基于Unisense數(shù)據(jù)的產(chǎn)氫速率（μmol H?/min/μmol cat）和TON。

 

研究意義

 

高時(shí)空分辨率動(dòng)力學(xué)解析：

Unisense電極實(shí)現(xiàn)秒級(jí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解H?濃度，捕捉傳統(tǒng)GC無(wú)法獲得的初始速率信息（圖4A-B斜率）。

例：光催化中人工酶（3）的產(chǎn)氫滯后現(xiàn)象（圖3B），揭示蛋白環(huán)境導(dǎo)致電子傳遞延遲。

 

揭示pH依賴性的動(dòng)態(tài)機(jī)制：

實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)（表1）結(jié)合GC終點(diǎn)（圖3C）發(fā)現(xiàn)：

pH 6時(shí)人工酶活性反超游離催化劑 → 蛋白微環(huán)境優(yōu)化局部質(zhì)子傳遞。

pH >7時(shí)速率下降 → 游離鈷肟受限于Co-H形成能壘，而人工酶受蛋白剛性限制。

 

量化傳質(zhì)限制效應(yīng)：

化學(xué)還原中（[Eu(EGTA)]2?過(guò)量），人工酶速率僅為游離催化劑40%（圖4），直接證明：

蛋白口袋的位阻效應(yīng)是速率限制主因（非電子轉(zhuǎn)移能力）。

光催化中因還原劑濃度低，速率差異被掩蓋（表1）。

 

指導(dǎo)后續(xù)設(shè)計(jì)：

數(shù)據(jù)表明：需在蛋白口袋引入質(zhì)子中繼基團(tuán)（如Glu/Lys）或柔性結(jié)構(gòu)域以平衡保護(hù)性與傳質(zhì)效率。

 

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

 

無(wú)損原位監(jiān)測(cè)：避免GC的取樣誤差，尤其適用于短壽命中間體研究。

高靈敏度：檢測(cè)限達(dá)μM級(jí)H?，精準(zhǔn)量化低濃度催化活性。

 

總結(jié)

 

該研究通過(guò)整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、電化學(xué)與實(shí)時(shí)傳感技術(shù)，證實(shí)從頭設(shè)計(jì)蛋白支架在可持續(xù)催化中的潛力。Unisense電極提供的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)數(shù)是揭示蛋白微環(huán)境對(duì)傳質(zhì)影響的關(guān)鍵，為下一代人工酶設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)與理論基石。